丹麦Aarhus 大学医院内分泌学和代谢系 P. B. Jeppesen, S. Gregersen, K. K. Alstrup, K. Hermansen 摘要 在巴拉圭和巴西的印第安人，多年来一直用从甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶子中提取的天然甜味剂甜菊甙治疗糖尿病。然而，对甜菊甙能降低血糖的作用机理却不了解。为了阐明甜菊甙和其葡糖苷配基对胰岛素释放的影响，本实验中采用了普通小鼠的胰岛和β-细胞系INS-1。在有16.7 mmol/L葡萄糖时，取决于剂量上的甜菊甙和甜菊醇(1nmol/L-1 mmol/L)都促进了从接种的小鼠胰岛分泌胰岛素。甜菊甙和甜菊醇的促胰岛作用严格按照一般的葡萄糖浓度，即甜菊甙(1mmol/L)和甜菊醇(1μmol/L)只有在葡萄糖高于8.3 mmol/L时才能促进分泌胰岛素。有趣的是，甜菊甙和甜菊醇的促胰岛作用是在缺乏细胞外Ca2+时才有。在有16.7 mmol/L葡萄糖时，在胰岛周边融合期间，甜菊甙(1 mmol/L) 甜菊醇(1μmol/L)具有长期和明显的可逆的促胰岛作用。为确定甜菊甙和甜菊醇是否对β细胞直接产生作用，其对INS-1的作用也进行了研究。甜菊甙和甜菊醇都对促进了INS-1细胞分泌胰岛素。不论是甜菊甙(1-100μmol/L)，还是甜菊醇(10 nmol/L-10 μmol/L)都不影响质膜K+腺苷三磷酸(K+ATP)-敏感通路活性，有没有改变胰岛中的环腺苷一磷酸(cAMP)水平。结论是甜菊甙和甜菊醇通过对β-细胞的直接作用促进了胰岛素的分泌。实验结果表明这些化合物作为抗高血糖剂对于治疗II型糖尿病具有潜在的作用。 甜叶菊(Stevia rebaudiana)将成为大量含有潜在新的抗糖尿病剂的化合物的来源。甜叶菊(Stevia rebaudiana)是一种菊科的草本植物，叶子中含有双萜甜菊糖苷及其菊糖苷配基甜菊醇。在巴拉圭和巴西印第安人，多年了一直用甜叶菊叶子的提取物治疗糖尿病。然而，对于这些假设的抗糖尿病物质的作用缺乏了解。当将甜叶菊干叶子添加到小鼠饲料中时发现了抗高血糖作用。Curi等人发现，当口服甜叶菊干叶子的提取物3天后，血葡萄糖有轻微下降。另外，据Ovieso等人报告，用甜叶菊叶子制成的茶，能使人的血糖下降35%。这表明甜菊甙和甜菊醇具有降低血糖的作用，对于治疗糖尿病具有潜力。但是对于人们对于抗高血糖作用的机理仍不了解。提出的问题是甜菊甙和甜菊醇是否对胰腺β-细胞具有直接的刺激性作用。本研究的目的就是确定是否甜菊甙和甜菊醇刺激正常小鼠的胰岛和β细胞系INS-1释放胰岛素。另外，我们希望阐明甜菊甙和甜菊醇是否通过干扰β-细胞中K+腺苷三磷酸(K+ATP)-敏感通路活性和/或者环腺苷一磷酸(cAMP)水平而发挥作用。 材料和方法 动物和胰岛的分离 采用了成年雌性NMR1小鼠(丹麦Ry公司Bomholtgard 育种和研究中心)，体重22-25 g。实验之前，动物用标准的颗粒饲料饲养，自由饮用自来水，光照期为12小时/12小时。用胶源酶消化技术分离得到胰岛。简单地说，用戊巴比妥(pentobarbital)经腹膜内(50 mg/kg)对动物进行麻醉，并采用了中线剖腹术。胰腺逆行灌注3 ml添加0.3 mg/ml 胶源酶P(德国墨尼黑Boehriger Mannheim GmbH公司生产)冰冻的Hanks平衡盐溶液([HBSS]西格玛化学公司生产)。随后将胰腺拿走，并在37℃条件下温育19分钟。在Hanks平衡盐溶液进行漂洗后，在体视显微镜下手挑选胰腺，并在37℃和95%大气和5%CO2条件下，在含有11.1mmol/L葡萄糖的10 ml RPMI1640中，并添加10%牛胎儿血清、2.06 mmol/LL-谷安酰胺、100 IU/ml青霉素G和100 μg/ml链霉素培育过夜。从6-10只小鼠得到用于培养和周边融合研究的胰岛，以弥补个体之间的差异。 胰岛的培养和周边融合 培养一夜之后，用添加有3.3mmol/L葡萄糖和0.1%人血清蛋白改性的Krebs-Ringer 缓冲剂(]西格玛化学公司生产)漂洗胰岛两次。Krebs-Ringer 缓冲剂含125mmol/L NaCl、5.9 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgCl2、1.28 mmol/L CaCl2、和25 mmol/L HEPES (pH 7.4, 西格玛化学公司生产)。对于用无Ca2+培养基中进行的实验，用0.5 mmol/L EGTA (]西格玛化学公司生产)替代CaCl2。在正常空气条件下预培养60分钟后，单个胰岛培养在根据设计方案含有葡萄糖和甜菊甙或者甜菊醇的100μL Krebs-Ringer 缓冲剂中，经过培养后，将50μL培养基冷冻，以便对胰岛素进行分析。 在周边融合实验中，将25个胰岛转移到周边融合室中，每个胰岛4个室。实验设计如下：(1) 3.3 mmol/L 葡萄糖时10分钟周边融合，(2) 16.7 mmol/L 葡萄糖时20分钟周边融合，(3) 16.7 mmol/L 葡萄糖和甜菊甙(1 mmol/L)或者甜菊醇(1 mmol/L)时20分钟周边融合，(4)&&&&&& 用戊巴比妥(pentobarbital)经腹膜(30 mg/kg)对动物进行麻醉，并放置在温控台上保持体温(直肠温度)。 在GK小鼠和韦斯塔小鼠的股脉两侧放置venflons (Instyte-NTM0.7 mm × 1.4 cm, 美国犹他州Becton Dickinson Vascular 公司)，以便采取血样和注药。15分钟后，葡萄糖(2.0 g/kg 体重)和甜菊甙(0.2 g/kg 体重)以大丸剂量(溶于0.3 ml 0.9%的盐水)从静脉注射。从美国的西格码化学公司得到甜菊甙(19-0-B-吡喃葡糖-13-0-[吡喃葡糖(1-2)]-B-吡喃葡糖甜菊甙)(纯度96%)。在对照实验中，只在静脉注射葡萄糖(2.0 g/kg 体重)。分别在时间点-15，0，15， 30， 60， 90 和120分钟采集血样。血液收集在含有3 μl抑蛋白酶酞/肝素混合物(抑蛋白酶酞7.7 mg/ml, 肝素为2300 IE/ml)的微管中。血样用等渗盐水替代防止体积减少(Rao等，1992)。 测定 应用葡萄糖氧化酶方法在YSI 2300 Star Plus(美国俄亥俄州Yellow Springs Instrument 公司生产)上测定葡萄糖。对血样进行离心(10分钟，4℃，4000 rpm)。除去血浆和进行冷冻，随后进行胰岛素和胰高血糖素测定。血浆胰岛素和胰高血糖素用RIA试剂盒 (美国Linco Research INC公司生产) 进行分析。 统计分析 通过Students不成对t-检验进行统计分析。考虑到显著差异为P<0.05。数据用平均数±SEM表示。计算的增量面积作为基础以上曲线下的面积(IAUC)。计算的曲线下的总面积(TAUC)作为零以上的面积。 结果 在活体葡萄糖耐性试验期间甜菊甙对麻醉GK小鼠的效果 如图1A所示，我们发现，在注入甜菊甙(n = 6)和生理盐水(n = 6)之前，两个麻醉GK小鼠组禁食血液葡萄糖(分别为5.8±0.4 mM对6.6±0.5 mM，NS)和血浆胰岛素水平(分别为171±32μU/ml对198±29μU/ml，NS)相似。甜菊甙(0.2 g/kg 体重)降低了对活体葡萄糖耐性试验(2.0 葡萄糖g/kg 体重)葡萄糖反应(图1A)。因此，接受甜菊甙的GK小鼠(648±50对958±85 mM × 120 分；P<0.05)葡萄糖的曲线下的增长量面积减少了。从30分钟开始和前面检测到较低的血糖水平。正如从图1B中所看到的，甜菊甙导致胰岛显著增加(曲线下的面积：51116±10967对21548±3101μU/ml × 120 分；P<0.05)。甜菊甙引起的胰岛素反应在整个120分钟的实验期间都增加。有趣的是，如图1C所示，胰高血糖素水平也同时受到抑制。这样，注射甜菊甙15分钟后胰高血糖素开始下降，同时，控制曲线到90分钟，在20分钟时达到控制水平。在GK小鼠中，甜菊甙显著降低了曲线下的总面积(TAUC) (5720±922对8713±901 pg/ml × 120 分；P<0.05)。 血液葡萄糖(mmol/L) (三个曲线图) 血浆胰岛素(μU/ml) 血浆胰高血糖素(pg/ml) 图1. 在对麻醉GK小鼠进行的活体葡萄糖耐性试验期间(2.0 g/kg 体重)，甜菊甙(0.2 g/kg 体重)对血液葡萄糖，血浆胰岛素和血浆胰高血糖素的影响。 (O) 只有葡萄糖(n = 6); (•) 甜菊甙(0.2 g/kg 体重)和葡萄糖(n = 6)。数据为平均±SEM 血液葡萄糖(mmol/L) (三个曲线图) 血浆胰岛素(μU/ml) 血浆胰高血糖素(pg/ml) 图2. 在对麻醉韦斯塔(Wistar)小鼠进行的活体葡萄糖耐性试验期间(2.0 g/kg 体重)，甜菊甙(0.2 g/kg 体重)对血液葡萄糖，血浆胰岛素和血浆胰高血糖素的影响。 (O) 只有葡萄糖(n = 12); (•) 甜菊甙(0.2 g/kg 体重)和葡萄糖(n = 14)。数据为平均±SEM 对麻醉韦斯塔(Wistar)小鼠进行的活体葡萄糖耐性试验期间甜菊甙的作用 在麻醉韦斯塔(Wistar)小鼠甜菊甙组(n=14)和对照组(n =12)也观察到类似的基础血液葡萄糖(4.3±0.3 mM对4.1±0.2 mM)和胰岛素(140±24μU/ml对147±26μU/ml)水平。如图2所示，在活体葡萄糖耐性试验期间，血液葡萄糖反应没有差异(IAUC: 416±43 mM对417±47 mM × 120 分)，不管是否注射了甜菊甙。然而，甜菊甙导致胰岛素水平显著而短时间的增长(79913±3107对17347±2882μU× 120 分; P<0.001)，90分钟后又降到对照水平(图2B)。甜菊甙未导致普通韦斯塔小鼠胰高血糖素的变化(TAUC：5493±527对5033±264 pg/ml × 120 分) (图2C)。 讨论 本研究表明，在活体葡萄糖耐性试验中，甜菊甙导致了麻醉的患糖尿病的GK小鼠血糖反应的降低，胰岛素分泌增加以及胰高血糖素水平提高。相比之下，甜菊甙未导致麻醉的普通韦斯塔小鼠血糖的任何变化，尽管甜菊甙导致胰岛素水平显著而短时间的增长。 在所有时间点，甜菊甙导致GK小鼠血糖水平下降3-4 mM, 总葡萄糖降低大约30%。与韦斯塔小鼠比较，在活体葡萄糖耐性试验中导致里较高的葡萄糖水平。在GK小鼠中，活体葡萄糖耐性试验后，在120分钟的实验期间，未达到基础葡萄糖水平，而在韦斯塔小鼠中，60-90分钟以后达到对照水平。然而，在GK小鼠中，注入甜菊甙后90分钟达到基础血糖水平。令人奇怪的是，在活体葡萄糖耐性试验期间，甜菊甙没有导致斯塔小鼠血糖降低，尽管导致胰岛素水平显著而短时间的增长。其中的原因现在还不知道。但是，Suanarunsawat和Chaiyahutr(1997)发现，在甜菊甙注入普通小鼠期间，未导致血糖降低。与之相比，他们观察到甜菊甙注入后循环血糖略有增加，但长期饲喂甜菊甙血糖水平不受影响。在韦斯塔小鼠中，甜菊甙未导致任何胰高血糖素降低似乎并不能说明血糖没有降低。 GK小鼠代表轻微2型糖尿病类型。现在还不清楚内分泌胰腺的组织病理学变化是否与高血糖的发病有关，或者是异常代谢改变。Movassat等(1997)发现，GK小鼠的血浆葡萄糖水平高于韦斯塔小鼠，而血浆胰岛素水平低于韦斯塔小鼠。另外，胰腺胰岛素含量、相对β细胞体积和β细胞总质量都较低，只有韦斯塔对照小鼠的23%( Movassat等, 1997)。在本研究中，与韦斯塔小鼠相比，GK小鼠的胰岛素水平也低，活体葡萄糖耐性试验后，GK小鼠的显示出轻微的高血糖和胰高血糖素水平。其他研究发现在GK小鼠胰岛中信号传导晚期缺损，可能发生在胞液二磷酸核苷激酶的激活位点，这在胞吐作用中是G-蛋白依赖步骤(Metz等，1999)。甜菊甙是否影响胰岛素胞吐作用中G-蛋白依赖步骤现在还不知道。因此，甜菊甙在糖尿病中抗高血糖作用的机理也了解不多。有趣的是，我们最近的研究表明，甜菊甙的促胰岛作用不同于典型的磺酰脲类，并不是与β细胞中的ATP(腺苷三磷酸)敏感的钾通道的关闭有关(Jeppesen等，2000)。甜菊甙除了因具有降低肝糖原分解潜力的胰高血糖素稳定作用之外，其他机理在甜菊甙的降低葡萄糖的作用中可能也发挥了作用。这些机理可能包括组织糖酵解增加、肌糖原贮积增加、肝糖原分解少或者尿葡萄糖损失增加。因此，研究显示出，按≥8mg/kg/h的剂量给小鼠静脉内注射甜菊甙导致尿葡萄糖清楚率增加(Melis, 1992)。在我们的实验中，使用的甜菊甙剂量要高的多(静脉注射0.2 g/kg )，我们不能排除肾葡萄糖清楚率增加的部分原因可能是血糖降低的作用。然而，在对II型糖尿病人进行的研究中，我们最近的研究表明，口服甜菊甙导致糖血对实验饭食反应明显降低，胰岛素升高和胰高血糖素受到抑制，但没有导致尿糖损失方面有任何显著变化(未发表的研究结果)。这一结论支持了我们的假设，即甜菊甙的抗高血糖效果主要是由于甜菊甙对产胰岛素β细胞和产胰高血糖素的α细胞。另外还提出，甜菊甙对小鼠肝脏线粒体中磷酸化作用的抑制，可能是由于ADP/ATP(腺苷二磷酸/腺苷三磷酸)交换受到抑制。至此，人们已经知道线粒体中ATP合成被抑制能导致糖酵解增加和糖异生作用降低(Vignais等，1966; Bracht等, 1985)。 就我们所知，这是对甜菊甙导致的在活体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌加强的首次论证。本研究中的数据进一步证明了我们对离体实验中从分离的小白鼠和韦斯塔小鼠胰岛分泌胰岛素的葡萄糖依赖增强作用的论证。在患糖尿病和正常小鼠中观察到胰岛素对甜菊甙反应动态的显著差异。因此，与在麻醉的韦斯塔小鼠对甜菊甙高而短暂的反应相比，在麻醉GK小鼠中出现对甜菊甙稳定增加的胰岛素反应。如预料的那样，韦斯塔小鼠最高的胰岛素水平高于GK小鼠的最高的胰岛素水平。在GK小鼠活体葡萄糖耐性试验中胰岛素水平缓慢稳定地增加，而在韦斯塔小鼠为迅速短暂的增加的原因现在还不了解。然而，这可能至少部分反映了GK小鼠显示的胰岛葡萄糖代谢反常。因此，GK小鼠胰岛的葡萄糖利用和氧化显著增加(Ostenson等，1993；Ling等，1998)，与韦斯塔对照小鼠显示出较高的胰岛葡萄糖-6-磷酸酶活性相比，GK小鼠胰岛葡萄糖循环显著较高(Ling等，2001)。另一种解释可能是甜菊甙对糖尿病患者的β细胞具有较高的亲和性，这是甜菊甙在GK小鼠体内的主要作用和(或者)改变的胰岛素清除率。 有趣的是，麻醉GK小鼠对注射甜菊甙的反应是血胰高血糖素降低。相比之下，麻醉的韦斯塔小鼠胰高血糖素没有显著变化。在GK小鼠注射甜菊甙后的头30分钟立刻发生胰高血糖素受到抑制，并且是最明显的。甜菊甙的胰高血糖素稳定作用，可能是由于对产胰高血糖素的α细胞的直接抑制作用，或者是通过胰岛素诱导的胰高血糖素分泌受到抑制的间接作用。然而，在GK小鼠体内缺乏对甜菊甙明显的第一相胰岛素反应以及发现尽管在韦斯塔小鼠中显著的胰岛素反应，但胰高血糖素没有变化，似乎不可能得出胰岛素与胰高血糖素抑制的直接相关。胰高血糖素稳定作用对甜菊甙对GK小鼠和韦斯塔小鼠血糖的不同影响起多大作用现在还不知道。 提出的问题是在饥饿状态下甜菊甙是否可能像sulphonylureas那样诱发低血糖，从而具有治疗糖尿病人的潜力。要回答这个问题，我们需要进行实验，例如，最禁食、神志清醒的GK小鼠和韦斯塔小鼠注射甜菊甙。在我们进行的离体研究中(Jeppesen等，2000)，我们发现，在葡萄糖浓度分别为8.3、11.1、16.7 mmol/L的时候，双萜甜菊甙促进了分离的小鼠胰岛释放。即使在葡萄糖在6.6 mmol/L时，也能发现胰岛素少量增加。然而，当葡萄糖在3.3 mmol/L的低浓度或者更低时，没有发现促胰岛作用(Jeppesen等，2000)。 应当强调的是，麻醉对葡萄糖水平、胰岛素水平、胰岛素释放和其他与这些激素有关的释放物可能具有显著作用。因此，对从麻醉的和未麻醉动物所获得的数据的解释应当仔细。 总之，甜菊甙对患糖尿病的GK小鼠具有抗高血糖、胰岛素释放以及胰高血糖素稳定的效果。甜菊甙对2型糖尿病人可能具有治疗作用。但是，对于甜菊甙的作用机理、效果、非糖血的好处、安全性和长期效果还需要更多的信息。 参考文献(略) |
